Diseño asistido por computadora de la inmovilización covalente de bromelina y papaína / Computer-aided design of bromelain and papain covalent immobilization

Enzymes as immobilized derivatives have been widely used in Food, Agrochemical, Pharmaceutical and Biotechnological industries. Protein immobilization is probably the most used technology to improve the operational stability of these molecules. Bromelain (Ananas comosus) and papain (Carica papaya) are cystein proteases extensively used as immobilized biocatalyst with several applications in therapeutics, racemic mixtures resolution, affinity chromatography and others industrial scenarios. The aim of this work was to optimize the covalent immobilization of bromelain and papain via rational design of immobilized derivatives strategy (RDID) and RDID1.0 program. Were determined the maximum protein quantity to immobilize, the optimum immobilization pH (in terms of functional activity retention), was predicted the most probable configuration of the immobilized derivative and the probabilities of multipoint covalent attachment. As support material was used Glyoxyl-Sepharose CL 4B. The accuracy of RDID1.0 program´s prediction was demonstrated comparing with experimental results. Bromelain and papain immobilized derivatives showed desired characteristics for industrial biocatalysis, such as: elevate pH stability retaining 95% and 100% residual activity at pH 7.0 and 8.0, for bromelain and papain, respectively; high thermal stability at 30 °C retaining 90% residual activity for both immobilized enzymes; a catalytic configuration bonded by immobilization at optimal pH; and the ligand load achieve ensure the minimization of diffusional restrictions.

Las enzimas inmovilizadas han sido ampliamente utilizadas en las industrias Alimentaria, Agroquímica, Farmacéutica y Biotecnológica. La inmovilización de proteínas es, probablemente, la tecnología más empleada para elevar la estabilidad operacional de estas moléculas. La bromelina (Ananas comosus) y la papaína (Carica papaya) son cisteín proteasas extensamente usadas como biocatalizadores inmovilizados con disímiles aplicaciones en la terapéutica, resolución de mezclas racémicas, cromatografía de afinidad, entre otros escenarios industriales. El objetivo del presente trabajo fue optimizar la inmovilización covalente de las enzimas bromelina y papaína a través de la estrategia de diseño racional de derivados inmovilizados (RDID) y el programa RDID1.0. Se predijo la cantidad máxima de proteína a inmovilizar, el pH óptimo de inmovilización (en términos de retención de la actividad funcional), la configuración más probable del derivado inmovilizado y la probabilidad de enlazamiento covalente multipuntual. Como soporte de inmovilización de empleó Glioxil-Sepharose CL 4B. La precisión de las predicciones llevadas a cabo con el programa RDID1.0 fue validada comparando con los resultados experimentales obtenidos. Los derivados inmovilizados de bromelina y papaína mostraron características deseadas para la biocatálisis a nivel industrial, tales como: elevada estabilidad al pH reteniendo el 95% y 100% de actividad residual a pH 7.0 y 8.0, para la bromelina y la papaína, respectivamente; una elevada estabilidad térmica con la retención del 90% de actividad residual a 30 °C para ambas enzimas; al pH de inmovilización óptimo la configuración obtenida es catalíticamente competente; y la carga de ligando alcanzada asegura la disminución de las restricciones difusionales.

Extraction systems for isolating esterases having interfacial adsorption / Sistemas de extracción para el aislamiento de esterasas con adsorción interfacial

En el presente trabajo se optimizaron las condiciones de extracción de esterasas con actividad en interfaces, a partir de la anémona marina Stichodactyla helianthus y del camarón peneido Litopenaeus vannamei Las esterasas interfaciales, cuya presencia en estas especies había sido informada previamente, presentan características funcionales que las hacen muy atractivas para su empleo industrial. Los homogenados de los animales se trataron con los detergentes Tritón X-100, Tween 20 y Tween 80 en dos concentraciones cada uno: la Concentración Micelar Crítica (CMC) y la mitad de ésta. Además se empleó NaCl 0,5 mol/L y n-butanol a las proporciones 5, 10 y 20%. Cada variante fue comparada con el método tradicional de extracción con agua destilada, que fue tomado como control. Los mejores resultados se obtuvieron empleando n-butanol al 20%, para recuperar las actividades esterasa y fosfolipasa, y al 10%, en el aislamiento de la actividad lipasa. La efectividad de este solvente en el aislamiento de estas enzimas con afinidad por las interfaces lípido/agua, pudiera estar dada por su capacidad para romper los agregados entre estas moléculas y causar la desorción de las mismas a los restos de membrana y tejidos presentes en la preparación.

Interfacial esterases present great functional versatility, making them very attractive molecules for industrial applications. The conditions for extracting interfacial esterases previously detected in the sea anemone Stichodactyla helianthus and the shrimp Litopenaeus vannamei were optimised in this work. Animal homogenates were treated with Triton X-100, Tween 20 and Tween 80 detergents at two different concentrations: critical micellar concentration (CMC) and half of that concentration; 0.5 mol/L NaCl and n-butanol at 5%, 10% and 20% v/v ratios were also tested. Each procedure was compared to the control extraction method using distilled water. The best results were obtained with 20% n-butanol for recovering esterase and phospholipase activity whilst 10% n-butanol extraction was the most effective for lipase activity isolation. This solvent’s suitability for isolating interface-activated enzymes could be explained by its ability to dissociate biomolecule aggregates and cause enzyme desorption from the membranes and tissues remaining in the preparation.

Separación de antígenos de Fasciola hepatica por cromatografía en gel / Separation of Fasciola hapatica antigens by gel chromatography

Se procedió al fraccionamiento de un extracto soluble de adultos de Fasciola hepatica mediante una cromatografía en Sephadex G-200, obteniéndose 6 picos bien definidos y simétricos. Se obtuvieron 6 fracciones y de éstas, las 5 primeras resultaron antigénicas al ser enfrentadas al antisuero de F. hepatica mediante la técnica de contrainmunoelectroforesis (CIEF) y dieron resultados positivos frente al suero de pacientes con fascioliasis, en cambio no se observó reacción positiva alguna frente a sueros humanos normales. Todas las fracciones, a excepción de los picos IV y V, presentaron reacciones cruzadas a ser enfrentadas a sueros de pacientes infectados con Ascaris lumbricoides, Angiostrongylus cantonensis y Schistosoma mansoni, lo cual demuestra que las fracciones IV y V presentan cierta especificidad para la fascioliasis y pudieran ser utilizadas en el diagnóstico de esta parasitosis a través del uso de la CIEF. Estas fracciones parecen ser componentes proteicos de bajo peso molecular que forman parte de los llamados antígenos metabólicos del parásito, ya que fueron los únicos que dieron resultados positivos al ser enfrentados a un antisuero preparado a partir de los antígenos de excreción-secreción del parásito adulto

Separación de antígenos de Dirofilaria immitis: II cromatografía en DEAE-celulosa / Separation of Dirofilaria immitis antigens : II DEAE-cellulose chromatography

Se utilizó la cromatografía DEAE celulosa a un pH 7,2 con solución amortiguadora Tris-HCL 0,1 M y utilizando un gradiente salino lineal con cloruro de sodio y resultó adecuada para separar fracciones antigénicas a partir de un extracto soluble de parásitos adultos de Dirofilaria immitis. Se lograron obtener 19 fracciones, una de las cuales presentó cierto grado de especificidad para la filariasis según los resultados obtenidos empleando la contrainmunoelectroforesis

Separación de antígenos de Dirofilaria immitis I: estudio preliminar del fraccionamiento por cromatografía de intercambio iónico / Separation of antigens of Dirofilaria immitis I: preliminary study of fractionation by ion-exchange chromatography

Se describe la selección de condiciones cromatográficas en DEAE-celulosa para el fraccionamiento de un extracto de parásitos adultos de Dirofilaria immitis. Es determinante el empleo de un gradiente de elución con cloruro de sodio en la resolución cromatográfica del extracto. Se logran obtener alrededor de 13 fracciones importantes. Se utilizó la electroforesis en geles de poliacrilamida para el análisis del fraccionamiento